Histologia - técnicas de preparação de lâminas

     Boa tarde internautas! Inauguro meu blog falando sobre a Histologia, uma das minhas matérias favoritas e da qual sou monitora na faculdade onde estudo!

     Bom, a Histologia, como o nome já diz, é o "estudo dos tecidos" com base em lâminas histológicas visualizadas em aparelhos chamados microscópios, sendo  mais comum o microscópio óptico (Fig.1). Vamos começar então, entendendo como é o processo de preparação dessas lâminas.

Figura 1: Partes do microscópio óptico (fonte: Google Imagens)

     O tecido a ser analisado deve ser preparado para permitir a passagem da luz através dele e a visualização de estruturas específicas através da aplicação de corantes específicos. O processo de preparação das lâminas é dividido em cinco etapas: fixação, desidratação e diafanização, inclusão, microtomia e coloração. 

1. Fixação

     Após a coleta da amostra biológica (biópsia, necrópsia ou peças cirúrgicas), deve-se primeiramente fixá-la com o objetivo de manter a estrutura e a composição mais próxima a do tecido in vivo e impedir a ação de bactérias e enzimas proteolíticas (autólise) que provocariam a degradação tecidual. A fixação pode ser realizada por métodos físicos (aquecimento, resfriamento) ou por métodos químicos (formol, líquido de Bouin). Os fixadores atuam estabelecendo ligações transversais entre as proteínas intra e intercelulares. Quando a amostra é espessa, realiza-se, a sua clivagem para permitir a melhor penetração do fixador. Outra peculiaridade está em amostras de tecido mineralizados, que precisam ser descalcificados para permitir a sua fixação.

2. Desidratação e diafanização:

     Fixada a amostra, procede-se a sua desidratação através de banhos de álcool em concentrações crescentes, de etanol 70% a etanol 100%. Após a desidratação, realiza-se a sua diafanização ou clareamento com a finalidade de substituir o etanol presente na amostra por um substância intermediária que seja miscível tanto em etanol como na substância utilizada na etapa seguinte (inclusão) para enrijecer a amostra. Essa substância intermediária é o xilol . Ao final desta etapa, os tecidos se tornam transparentes. 

  

3. Inclusão:

     Após a diafanização, a amostra é colocada em parafina (microscopia de luz) ou em resina (microscopia de luz e eletrônica) a fim de torná-la rígida e, dessa forma, permitir o corte em lâminas finas no micrótomo. Ao ser imersa em parafina fundida e colocada em uma estufa a 58-60°C, o calor promove a evaporação do xilol e a ocupação dos espaços teciduais por parafina. O tecido embebido por parafina se torna rígido após ser retirado da estufa. Uma das vantagens da resina em relação à parafina é que aquela produz menos artefatos, gerados pela alta temperatura da estufa. 

4. Microtomia

     Na penúltima etapa, os blocos de tecido são levados ao micrótomo para serem cortados em cortes finos de 1 a 10µm. A microtomia também pode ser efetuada em espécimes congelados, seja em nitrogênio líquido seja por congelamento rápido, no braço de um criostato a -20°C com uma lâmina de aço pré-resfriada. 

5. Coloração

     As lâminas são, em seguida, coradas com corantes específicos para que possam ser visualizadas e diferenciadas as estruturas específicas que se quer observar. Os corantes são hidrossolúveis e podem ser acidófilos ou basófilos. Os corantes basófilos são básicos e coram estruturas teciduais ácidas como os ácidos desoxirribonucléico (DNA) e ribonucléico (RNA), o núcleo e os ribossomos. Como exemplo de corantes basófilos, destacam-se a Hematoxilina, o Azul de Metileno e o Azul de Toluidina. Os corantes acidófilos são ácidos e coram estruturas teciduais básicas como as mitocôndrias, os grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e colágeno. Como exemplo de corantes acidófilos, destacam-se a Eosina, Orande G, Fucsina ácida.  

     A combinação mais utilizada é a de Hematoxilina com Eosina (HE). A Hematoxilina cora em azul ou violeta e a Eosina, em cor-de-rosa. Outros corantes utilizados são os tricrômios (corantes de Mallory e Masson), importantes na diferenciação entre colágeno e músculo liso. Além deles, a impregnação por metais, como a prata e o ouro, é comum no estudo de tecido nervoso.

Figura 2: Lâmina histológica corada em HE mostrando tecido conjuntivo denso modelado (*) com fibras colágenas coradas em rosa e núcleos de fibrócitos corados em roxo. (Fonte: http://www.biologia.seed.pr.gov.br/modules/galeria/uploads/3/normal_2cartitraeso.jpg).

     Se quiserem conhecer mais a prática dessas técnicas, recomendo a sequência do seguinte vídeo: "Técnicas Histológicas - Uma abordagem prática - Fiocruz/ SBH" (https://www.youtube.com/watch?v=55hm1o_JPUk).